文章名稱：Regulating cleavage activity and enabling microRNA detection with split sgRNA in Cas12b
中文名稱：基于Cas12b的分裂型sgRNA，實現(xiàn)其切割活性調(diào)控，并支持microRNA檢測
雜志名：Nature Communications
期刊影響因子：15.7
第一作者：Jiaqi Wang
通訊作者：Zhaoxing Liu
發(fā)表日期：2025.07.10
doi：10.1038/s41467-025-61748-4
研究內(nèi)容
內(nèi)容概述：本研究提出了一種將Cas12bsgRNA 拆分為兩個片段（即“分裂 sgRNA”）的策略。該策略利用通用骨架結(jié)構(gòu)與可定制的 Spacer 區(qū)域相結(jié)合，實現(xiàn)了對 Cas12b 切割活性的精確調(diào)控。同時，此方法支持無需核酸擴增的 microRNA 直接檢測。研究結(jié)果表明，通過優(yōu)化 sgRNA 結(jié)構(gòu)可有效降低脫靶效應(yīng)并抑制背景切割信號，從而構(gòu)建了一個具有高靈敏度和高特異性的 microRNA 檢測平臺。
研究背景
在基因編輯和核酸檢測領(lǐng)域，Cas12b是一種極具潛力的 CRISPR-Cas 系統(tǒng)。然而，傳統(tǒng) sgRNA 設(shè)計易引發(fā)背景切割和脫靶效應(yīng)，需更精細(xì)的活性調(diào)控策略。同時，作為重要生物標(biāo)志物的 microRNA，其檢測面臨濃度低、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等挑戰(zhàn)。為此，本研究旨在開發(fā)一種新型 sgRNA 架構(gòu)，在實現(xiàn)對 Cas12b 活性精準(zhǔn)調(diào)控的同時，支持無需擴增的 microRNA 直接檢測。
實驗方法與過程
sgRNA 分裂設(shè)計：將 sgRNA 拆分為 scaffold 部分與 Spacer 部分分別表達或組裝。
活性調(diào)控評估：通過體外Cas12b 切割實驗驗證不同組合，測定切割效率與背景活性。
microRNA 檢測方案建立：結(jié)合報告片段和熒光信號輸出，無需逆轉(zhuǎn)錄擴增即可檢測目標(biāo) microRNA。
靈敏度與特異性測試：在多種microRNA 濃度梯度中測試檢測下限與選擇性。
Cas12b的sgRNA和分裂sgRNA的方案概述
實驗結(jié)果
活性調(diào)控：成功拆分sgRNA 顯著降低 Cas12b 的非特異背景切割，僅在配對正確 Spacer 后激活強信號。
高靈敏檢測：檢測下限達到picomolar 級別，背景噪音較低。
microRNA 特異性良好：能區(qū)分近似序列差異較小的 microRNA，通過 Spacer 定制即可切換檢測目標(biāo)。
結(jié)論
split sgRNA 的設(shè)計具備普適性，只需更換 Spacer 即可擴展至不同 microRNA 或 DNA 靶標(biāo)，且無擴增的檢測方法可以簡化流程、降低成本與污染風(fēng)險。該平臺具備潛力推廣至臨床快速診斷設(shè)備或現(xiàn)場檢測（POCT）應(yīng)用。未來可與納米載體、光學(xué)傳感設(shè)備等結(jié)合，提升整體檢測便利性與應(yīng)用范圍。
使用改良的CRISPR-Cas12b 系統(tǒng)檢測 miR-17、21、31 和 92a 的表達量
使用同樣的檢測方法檢測健康人（H.D.1–5）、結(jié)直腸癌患者術(shù)前（P.D.1–5 preO） 和 術(shù)后（P.D.1–5 postO） 血漿總 RNA 中的 miR-17、21、31 和 92a 水平
Cas12b split sgRNA 方法 與傳統(tǒng) RT-qPCR 方法對比
論文中用到的NEST產(chǎn)品
NEST胎牛血清的優(yōu)勢
